乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可導(dǎo)致慢性乙型肝炎（CHB）、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計，2022年約有2.54億人感染慢性乙肝，新增120萬感染病例。此外，2022年乙肝導(dǎo)致約110萬人死亡，主要緣于肝硬化和肝細(xì)胞癌（原發(fā)性肝癌）。HBV是嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，但目前可選擇的治療方案十分有限。

HBV基因組是一個松弛環(huán)狀DNA（rcDNA），包含4個重疊的開放閱讀框，分別為S、C、P和X（圖1），進(jìn)入宿主細(xì)胞核會被內(nèi)源性酶修復(fù)成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），cccDNA編碼核心抗原（HBcAg）、表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和X蛋白（HBx）4個重疊的開放閱讀框（ORFs），也是HBeAg陽性患者HBsAg的主要來源。此外，不能復(fù)制的HBV線性片段可以整合到宿主基因組中（intHBV），整合HBV DNA是HBeAg陰性患者HBsAg的主要來源。CHB患者理想的治療終點(diǎn)是HBsAg持續(xù)陰性和/或抗HBs陽性，但由于完全清除cccDNA和整合HBV DNA是無法實(shí)現(xiàn)，因此CHB的治療目標(biāo)是在有限療程內(nèi)的持續(xù)治療實(shí)現(xiàn)HBsAg血清的清除。

圖1 HBV RNAs的結(jié)構(gòu)和siRNA候選位置

RNA干擾（RNAi）技術(shù)可以通過誘導(dǎo)抗原抑制、減輕病毒血癥和沉默cccDNA來實(shí)現(xiàn)HBV的功能性治愈，因此這一技術(shù)在治療遺傳疾病和病毒感染方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。然而，考慮到HBV的10種不同基因型（A到J）之間有較高的遺傳多樣性，設(shè)計針對HBV的功能性siRNA具有很大的挑戰(zhàn)性。

隨著針對 COVID-19 的mRNA疫苗的成功以及多種 RNAi藥物的批準(zhǔn)，RNA 醫(yī)學(xué)時代已成為現(xiàn)實(shí)。大量的研究集中在開發(fā)遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）、與N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的化學(xué)綴合等，以增強(qiáng) RNAi 療法的不良細(xì)胞攝取和不足的藥代動力學(xué)特性，從而提高其功效和安全性。然而，目前的RNAi治療大多僅限于肝臟疾病，受到肝臟靶向的嚴(yán)重限制。因此，RNAi治療靶向肝外組織并最終擴(kuò)展其治療各種疑難雜癥，存在巨大的未滿足的醫(yī)療需求。

綜上，迫切需要設(shè)計廣泛針對HBV多種基因型并同時抑制HBsAg表達(dá)和cccDNA轉(zhuǎn)錄的siRNA以及開發(fā)安全高效的遞送系統(tǒng)，以提高乙肝病毒感染治療效果。

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）通常可電離的陽離子脂質(zhì)、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)（PEG lipids）和輔助脂質(zhì)組成。該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，羥基-PEG化LNPs可顯著降低與人體血液中存在的抗PEG抗體的吸附及其后續(xù)補(bǔ)體激活，抗原性較甲氧基-PEG化LNPs更弱，一定程度上避免產(chǎn)生PEG特異性抗體，使LNPs逃逸抗體識別和快速清除。

RNAi和抗體介導(dǎo)的HBsAg清除可以通過降低HBV病毒負(fù)荷來消除免疫功能障礙，但無法激活病毒特異性T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)對病毒的長期控制。有研究表明，IL-2是實(shí)現(xiàn)病毒抗原呈遞以及特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的激活和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。低劑量IL-2與IFN-α的序貫給藥可增加HBV患者體內(nèi)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的頻率并恢復(fù)其功能。研究團(tuán)隊認(rèn)為，通過RNAi療法來抑制HBV病毒載量，同時使用IL-2來增強(qiáng)宿主免疫，可能足以打破免疫耐受，重建抗病毒免疫。

基于以上背景及發(fā)現(xiàn)，復(fù)旦大學(xué)袁正宏、占昌友及上海交通大學(xué)付煒等研究團(tuán)隊在 《Signal Transduction and Targeted Therapy 》上發(fā)表了題為“Optimized RNA interference therapeutics combined with interleukin-2 mRNA for treating hepatitis B virus infection ”的創(chuàng)新性研究成果。該團(tuán)隊篩選并修飾了一種針對HBV全基因型和全靶點(diǎn)的多功能siRNA組合藥物（siHBV），使用自主開發(fā)的新型脂質(zhì)納米粒遞送系統(tǒng)（tLNP）實(shí)現(xiàn)其在動物體內(nèi)高效安全的肝靶向輸送（tLNP/siHBV）。此外，該研究開發(fā)了一種治療HBV的聯(lián)合療法，使用tLNP共載siHBV與IL-2 mRNA（tLNP/siHBVIL2）。以上成果為推動HBV感染治療領(lǐng)域發(fā)展提供了新的策略。

功能性siRNA的設(shè)計、篩選和體外評價

研究團(tuán)隊對HBV基因組進(jìn)行了測序分析， 設(shè)計并篩選可針對HBV高保守序列、同時高效抑制HBsAg、整合HBV DNA和HBx的一系列siRNA。在兩種HBV相關(guān)細(xì)胞模型中評價序列及序列組合功效，并對其生物活性、細(xì)胞毒性和血清穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測，最終篩選得到優(yōu)選的序列組合（si-1260和si-1848的組合，簡稱“siHBV”）。siHBV具有廣泛的基因型覆蓋率（98.55%）和靶點(diǎn)覆蓋率（所有cccDNA及intHBV來源的HBV RNA）、較低的脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性，為HBV治療提供了一種具有顯著優(yōu)勢的新siRNA候選藥物。

新型脂質(zhì)納米粒遞送系統(tǒng)（tLNP）

配方的篩選和評價

研究團(tuán)隊基于前期發(fā)現(xiàn)，使用新型脂質(zhì)納米粒遞送系統(tǒng)（tLNP）：對PEG脂質(zhì)進(jìn)行羥基修飾的同時，進(jìn)一步優(yōu)化了其在LNPs配方中的摩爾比。具體如下：對含不同端基（甲氧基OMe/羥基OH-PEG）/比例（1.5%/3%）PEG脂質(zhì)的LNP進(jìn)行體內(nèi)性能的研究，以靶向肝細(xì)胞的特異性低密度脂蛋白(LDL)載脂蛋白B（ApoB）的siRNA（siApoB）為模式siRNA，評價包封siRNA LNP的遞送性能。最終篩選得到的脂質(zhì)處方：SM-102:DSPC:HO-PEG2000-DMG: CHOL =50:10:3:38.5，mol/ mol。

（mRNA-1273脂質(zhì)處方：SM-102:DSPC:DMG-PEG2000: CHOL =50:10:1.5:38.5，mol/mol）

文中脂質(zhì)輔料均購自艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司。

圖3 基于LNP的siRNA遞送系統(tǒng)的優(yōu)化

siHBV和mIL-2 mRNA共遞送系統(tǒng)（tLNP/siHBVIL2）的構(gòu)建和療效評價

本研究首先評價tLNP/siHBV在細(xì)胞小鼠模型中的抗病毒效果和生物安全性，結(jié)果顯示tLNP/siHBV未觸發(fā)細(xì)胞因子表達(dá)，測定肝內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因證實(shí)tLNP/siHBV的低免疫原性，在單次或多次（5次）給藥頻率下均呈劑量和時間依賴性，綜上tLNP/siHBV具有良好的靶向治療效果和安全性?；谝陨辖Y(jié)果，將siHBV與編碼小鼠白細(xì)胞介素-2（mIL-2）的mRNA共同封裝在tLNP中，以增加HBV特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)頻率，打破免疫耐受，實(shí)現(xiàn)更好的病毒抗原抑制與免疫控制。

圖4 tLNP/siHBVIL2在小鼠模型中的抗病毒效果評價

結(jié)語

總之，本研究針對HBV全基因組篩選出多功能siRNA組合（siHBV），利用高效安全的tLNP的遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)siHBV和mIL-2 mRNA共遞送聯(lián)合療法，為進(jìn)一步治療CHB提供一種可行的方法，也為LNPs遞送系統(tǒng)在核酸藥物治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的策略。