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本期A(yíng)VT小編給大家?guī)?lái)一篇好文分享,來(lái)自《中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》2020年第51卷第6期論文——用于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的即時(shí)檢測(cè)方法研究進(jìn)展,感興趣的小伙伴快來(lái)看一下吧!
文章作者:鮑瑤菲 1 薛茜茹 1 武海萍 2 鄒秉杰 2 宋沁馨 1 周?chē)?guó)華 2,3
本文亮點(diǎn)
新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)已蔓延至全球,其傳染性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng),且存在無(wú)癥狀感染者,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。在缺乏特xiao藥物并且疫苗尚未大面積使用的情況下,準(zhǔn)確快速地甄別出 SARS-CoV-2 感染者, 并對(duì)其實(shí)施隔離是目前疫情防控的最有效手段。核酸檢測(cè)在此次疫情防控中起到了至關(guān)重要的作用,尤其對(duì)于無(wú)癥狀感染者的確診和康復(fù)期患者的出院評(píng)判,SARS-CoV-2核酸檢測(cè)成為了主要標(biāo)準(zhǔn)。但是基于實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化核酸檢測(cè)方法周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)、成本高,因此急需開(kāi)發(fā)便捷檢測(cè)新冠病毒的方法,實(shí)現(xiàn)在資源有限的情況下快速測(cè)試并及時(shí)控制疫情。本文主要從提取、核酸擴(kuò)增、檢測(cè)和商業(yè)一體化即時(shí)檢測(cè)方法四個(gè)方面總結(jié)了目前已有的針對(duì)新冠病毒開(kāi)發(fā)的核酸即時(shí)檢測(cè)方法(point-ofcare testing,POCT)及其原理。宋沁馨教授課題組也正在開(kāi)發(fā)基于核酸侵入反應(yīng)技術(shù)和納米金可視化檢測(cè)原理的新冠病毒快速檢測(cè)新方法,以期能夠?yàn)闄z測(cè)能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時(shí)篩查提供參考。合理利用即時(shí)檢測(cè)可以分擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)擔(dān),提高各國(guó)對(duì)疫情快速篩查、及時(shí)防控的能力,為SARS-CoV-2及其他新興傳染病的緊急應(yīng)對(duì)和快速部署提供參考。
【摘要】
新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在全世界范圍內(nèi)快速傳播,截至2020年9月30日全球感染人數(shù)已達(dá)3 300萬(wàn)人,造成100多萬(wàn)人死亡,給公眾的生命健康造成嚴(yán)重威脅?;趯?shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化核酸檢測(cè)方法周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)、成本高,因此急需開(kāi)發(fā)便捷檢測(cè)新冠病毒的方法,實(shí)現(xiàn)在資源有限的情況下快速測(cè)試以及時(shí)控制疫情。本文從提取、擴(kuò)增、檢測(cè)3個(gè)方面總結(jié)了針對(duì)新型冠狀病毒所開(kāi)發(fā)的核酸即時(shí)檢測(cè)方法(point-of-care testing,POCT),并對(duì)整合了這3個(gè)步驟的商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)裝置進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹,以期為COVID-19及其他新興傳染病的緊急應(yīng)對(duì)和快速部署提供參考。
【關(guān)鍵詞】新型冠狀病毒; 核酸檢測(cè); 即時(shí)檢測(cè); 進(jìn)展
自新型冠狀病毒首ci出現(xiàn)以來(lái),在全世界范圍內(nèi)快速傳播,現(xiàn)已至全球大流行,截至2020年9月30日全球感染人數(shù)已達(dá)3 300萬(wàn)人,造成100多萬(wàn)人死亡,且確診人數(shù)和死亡人數(shù)還在持續(xù)增加,給全球經(jīng)濟(jì)和公眾健康都造成了嚴(yán)重的威脅。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將這種新的冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2),SARS-CoV-2是一種單鏈正股RNA病毒,目前用于檢測(cè)SARS-CoV-2的基因靶標(biāo)有核衣殼(N)、包膜(E)、刺突(S)、RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(RdRP)和開(kāi)放閱讀框架1ab(ORF1ab)基因等。
基于核酸的檢測(cè)方法具有高靈敏度和低假陰性率的優(yōu)勢(shì),相對(duì)其他檢測(cè)方法(如抗體檢測(cè))更靈敏、特異性更好,目前各國(guó)檢測(cè)新冠病毒最普遍方法為對(duì)口咽或鼻咽拭子進(jìn)行基于實(shí)驗(yàn)室的病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR),這已成為用于確診新冠感染的金標(biāo)準(zhǔn),被中國(guó)國(guó)jia衛(wèi)建委、WHO等作為新冠確診的重要依據(jù)。但這種方式普遍檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(約1.5~ 2 h),需要昂貴的大型儀器、專(zhuān)門(mén)的試劑、專(zhuān)業(yè)的操作人員以及在完備的符合生物安全條件的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行,并不適合及時(shí)檢測(cè),這就導(dǎo)致無(wú)法在第一時(shí)間對(duì)疑似病例進(jìn)行及時(shí)快速的檢測(cè),遲滯疫情防控工作的進(jìn)行,對(duì)公共安全造成潛在影響。因此急需能夠在資源有限的情況下實(shí)現(xiàn)快速便捷檢測(cè)新冠病毒的方法以及時(shí)控制疫情,即時(shí)檢測(cè)(point-of-care testing,POCT)又稱(chēng)床旁檢測(cè)就成為了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程很好的補(bǔ)充,它是指在采樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到結(jié)果的一種檢測(cè)方式。即時(shí)檢測(cè)不僅適用于臨床實(shí)驗(yàn)室,還可以由受過(guò)簡(jiǎn)單訓(xùn)練的非實(shí)驗(yàn)室人員在樣品采集現(xiàn)場(chǎng)(例如床旁,醫(yī)生辦公室或急診室)中進(jìn)行。此外,即時(shí)檢測(cè)只需要很少的操作步驟,通常無(wú)需培訓(xùn)或只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可熟練掌握,結(jié)果易于讀取,具有準(zhǔn)確、快速、便攜、簡(jiǎn)便和低成本的優(yōu)勢(shì),有利于更快的臨床決策并從專(zhuān)業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室分擔(dān)工作負(fù)荷,加快篩查速度、控制疫情。
本文主要從提取、核酸擴(kuò)增、檢測(cè)和商業(yè)一體化即時(shí)檢測(cè)方法4個(gè)方面總結(jié)了目前已有的針對(duì)新冠病毒開(kāi)發(fā)的即時(shí)檢測(cè)方法及其原理,以期為檢測(cè)能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時(shí)篩查提供參考,合理利用即時(shí)檢測(cè)可以分擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)擔(dān),提高各國(guó)對(duì)疫情快速篩查、及時(shí)防控的能力。
1 樣本提取
新冠檢測(cè)可用的樣本類(lèi)型包括肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、痰液樣本等,其中最常用為鼻咽拭子,但鼻咽拭子的采集需要專(zhuān)業(yè)醫(yī)護(hù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范操作,采集過(guò)程中受試者會(huì)有不適感且對(duì)于醫(yī)護(hù)人員來(lái)說(shuō)有暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此選擇一種采集更便捷的樣本類(lèi)型將更適合即時(shí)檢測(cè)。早先已有研究發(fā)現(xiàn)在唾液中可以檢出新冠病毒,唾液樣品收集快速、無(wú)創(chuàng),價(jià)格低廉并且易于存儲(chǔ),還可以避免收集鼻咽拭子樣本的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)患者和醫(yī)療保健提供者而言更加安全,并且唾液樣本采集方便不需要熟練的技術(shù)人員,適合非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境甚至居家檢測(cè)。Lamb等設(shè)計(jì)針對(duì)開(kāi)放閱讀框ORF1ab的NSP3編碼區(qū)的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP),在30~45 min內(nèi)完成模擬患者唾液樣品中特異性檢測(cè)SARS-CoV-2,與RT-PCR陽(yáng)性一致率為95%(N = 19/20)。SalivaDirect方法也采用唾液作為檢測(cè)樣本,將核酸提取步驟替換成簡(jiǎn)單的蛋白酶K和熱處理步驟,與基于鼻咽拭子純化提取的常規(guī)RT-PCR方法相比相關(guān)性達(dá)94%,且該檢測(cè)流程能與多種RT-PCR試劑盒兼容,極大縮短了檢測(cè)時(shí)間。
此外,RUCDR Infinite Biologics開(kāi)發(fā)的新唾液收集方法將比目前的鼻咽拭子方法更適合進(jìn)行廣fan的人群篩查,提供了一種方便的樣品收集方法來(lái)開(kāi)發(fā)價(jià)格適宜的即時(shí)護(hù)理測(cè)試套件,F(xiàn)DA已為該方法授予了緊急使用授權(quán)(EUA)。唾液作為一種樣本收集方法,對(duì)COVID-19患者SARS-CoV-2的檢測(cè)具有良好的準(zhǔn)確性,有替代鼻咽拭子用作SARS-CoV-2的即時(shí)檢測(cè)樣本的潛力,但唾液中病毒載量在癥狀出現(xiàn)的第1周zui高,隨后會(huì)隨時(shí)間下降,與鼻咽拭子相比靈敏度有所下降。
目前手動(dòng)RNA提取限制了新冠即時(shí)檢測(cè)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,常規(guī)的RNA提取意味著更長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間,更多的人力、試劑的成本,以及處理臨床標(biāo)本時(shí)交叉污染和生物安全的風(fēng)險(xiǎn)。為了優(yōu)化提取步驟,Zhao等利用基于帶有羧基涂層的聚氨基酯磁性納米顆粒(pcMNPs)在20 min內(nèi)從多個(gè)樣品中進(jìn)行病毒RNA提取,該方法將裂解和結(jié)合合并為一個(gè)步驟,并且pcMNPs-RNA復(fù)合物可以直接引入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)中。
除了新的提取方法外,免提取方法的開(kāi)發(fā)也是一種解決思路。Wee等提出了一種稱(chēng)為直接快速免提取PCR(DIRECT-PCR)的方法,使用抗抑制劑的酶和試劑來(lái)免除RNA提取步驟,可在 36 min內(nèi)在市售便攜式PCR熱循環(huán)儀上完成快速直接PCR檢測(cè),針對(duì)呼吸道樣品中的病毒核衣殼(N)基因每個(gè)反應(yīng)zui低可檢測(cè)到6個(gè)拷貝,減少了實(shí)驗(yàn)室人員的操作時(shí)間和生物安全風(fēng)險(xiǎn)且具有便攜性,可在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室之外進(jìn)行。在基于等溫?cái)U(kuò)增原理開(kāi)發(fā)的方法中發(fā)現(xiàn),病毒運(yùn)輸介質(zhì)可能包含一種或多種抑制劑,將鼻咽拭子直接置于病毒運(yùn)輸介質(zhì)中不進(jìn)行RNA分離步驟直接進(jìn)行RT-LAMP,會(huì)使RT-LAMP的有效性降低。Wei等開(kāi)發(fā)了一種直接在鼻咽拭子后的病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)上檢測(cè)的方法,無(wú)需事先提取RNA,敏感性為85%,可以兼容不同制造商的試劑探針。雖然病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)仍會(huì)使檢測(cè)靈敏度有所降低,但可以簡(jiǎn)化工作流程,縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間,更適合即時(shí)檢測(cè)。此外,超高靈敏度的檢測(cè)方法也可無(wú)需進(jìn)行額外的樣品處理或RNA純化。
2 核酸擴(kuò)增
2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)
RT-PCR是目前檢測(cè)新冠病毒核酸最普遍的方法,利用該原理開(kāi)發(fā)的試劑盒數(shù)量占比也是最多的。RT-PCR的原理為利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)換為與其互補(bǔ)的cDNA,隨后cDNA的特定區(qū)域經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增,在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過(guò)程中或終點(diǎn)處讀取熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。
基于實(shí)驗(yàn)室的RT-PCR應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)的主要障礙包括:實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀通常體積較大、操作復(fù)雜需要專(zhuān)業(yè)人員、周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)等。這些在即時(shí)檢測(cè)上的局限性促使研究人員探索在保持常規(guī)RT-PCR的靈敏度和特異性的同時(shí)簡(jiǎn)化和縮短流程的方法。在RT-PCR的樣品擴(kuò)增階段,需要熱循環(huán)儀來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度的程序變化,但熱循環(huán)儀成本較高,在資源缺乏地區(qū)難以大量配備。Arumugam等開(kāi)發(fā)了一種水浴加熱儀器替代PCR循環(huán)儀,包含兩個(gè)水?。阂粋€(gè)用于變性,另一個(gè)用于逆轉(zhuǎn)錄,然后使用電機(jī)操作臂將PCR管穿梭在兩個(gè)水浴之間進(jìn)行退火延伸步驟,這臺(tái)設(shè)備造價(jià)便宜,可實(shí)現(xiàn)96個(gè)樣本同時(shí)處理,若使用薄膜PCR反應(yīng)管可在12 min內(nèi)完成反應(yīng),與臺(tái)式PCR儀相比速度明顯提升,適合在欠發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用。
2.2 等溫?cái)U(kuò)增
核酸等溫?cái)U(kuò)增無(wú)需進(jìn)行熱循環(huán)步驟,可以在恒定溫度下快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增,是RT-PCR最有潛力的替代方法,能實(shí)現(xiàn)與RT-PCR相似水平的病毒RNA檢測(cè)且更加適合應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)。目前用于即時(shí)檢測(cè)的常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)和Nicking酶輔助反應(yīng)(NEAR)技術(shù)。
2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)
RT-LAMP原理見(jiàn)圖1,首先將SARS-CoV-2的RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再設(shè)計(jì)4個(gè)能與靶基因組上6個(gè)不同區(qū)域結(jié)合的特殊設(shè)計(jì)的引物,使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶替代熱變性生成單鏈模板,在四引物系統(tǒng)中,有兩個(gè)內(nèi)部引物和兩個(gè)外部引物。正向內(nèi)部引物的3′末端引發(fā)了初始DNA鏈的合成,隨后被正向外部引物引發(fā)的合成所取代。正向內(nèi)部引物的5′末端的反向互補(bǔ)序列與置換的ssDNA鏈中的下游序列退火,形成一個(gè)環(huán)。然后在每個(gè)末端環(huán)上的ssDNA充當(dāng)LAMP擴(kuò)增循環(huán)的起始,使目標(biāo)序列被指數(shù)擴(kuò)增。LAMP具有很高的特異性和敏感性,操作簡(jiǎn)單,在60~65 ℃的恒溫下不到1 h即可完成,避免了使用熱循環(huán)儀的麻煩,并且由于使用了更多的引物因此具有很高的特異性??梢酝ㄟ^(guò)添加pH敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等進(jìn)行可視化檢測(cè)。
圖1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)原理示意圖
Yu等開(kāi)發(fā)了名為iLACO的資源缺乏地區(qū)即時(shí)檢測(cè)方案,以O(shè)RF1ab的片段作為靶標(biāo),在65 ℃的水浴中溫育,每毫升1 000個(gè)拷貝的濃度可以在20 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果,但還不足以進(jìn)行低病毒載量樣本的靈敏篩查。為了實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度和特異性,Yang等對(duì)不同靶標(biāo)進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)ORF1ab基因具有很高的特異性但靈敏度低,而N基因具有很高的靈敏度但特異性不足,同時(shí)檢測(cè)ORF1ab基因,E基因和N基因可以保證對(duì)SARS-CoV-2的敏感性和特異性。為了提高擴(kuò)增效率和耐受性,Lu等開(kāi)發(fā)了基于SARS-CoV-2的N基因的利用高保真DNA聚合酶的單步單管耐錯(cuò)配擴(kuò)增技術(shù),可除去擴(kuò)增過(guò)程中引物3′端的錯(cuò)配堿基,具有極好的耐受性,檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)118.6個(gè)拷貝。該分析的檢測(cè)速度比一般LAMP反應(yīng)更快,可在不到20 min得到結(jié)果。作為一種常見(jiàn)的反應(yīng)平臺(tái),微流控芯片具備將所有試劑存儲(chǔ)在芯片上的能力,能夠整合并簡(jiǎn)化操作步驟,對(duì)于消除對(duì)大型設(shè)備的需求至關(guān)重要,將微流體設(shè)備與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合使用可以為大眾提供更方便、便宜、便攜的新冠檢測(cè)方法。以上這些LAMP方法用于即時(shí)檢測(cè)均需要熱板或水浴,Gonzalez等報(bào)告了一種3D打印孵育室的開(kāi)發(fā),將靶向N基因的比色 RT-LAMP反應(yīng)與用于市售Eppendorf PCR管的3D打印孵育室相結(jié)合,可以允許十二管反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,3D打印孵育室可以大規(guī)模生產(chǎn),為基于LAMP的即時(shí)檢測(cè)提供了一種高成本效益的反應(yīng)平臺(tái)。
LAMP方法靈敏度高、特異性好,具有恒溫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì),無(wú)需使用熱循環(huán)儀進(jìn)行溫度程序設(shè)置,更加有利于即時(shí)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。然而,由于LAMP需在60~65 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增,仍然需要水浴、熱板等外部設(shè)備提供恒定的溫度,不利于設(shè)備小型化便攜化,因此在常溫下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增的方法在即時(shí)擴(kuò)增領(lǐng)域更有前景。
2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)
RPA也是一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法,相比于LAMP反應(yīng)溫度更低,在常溫下就可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng),無(wú)需外部加熱部件。RPA的原理見(jiàn)圖2,主要依賴(lài)于3種酶:能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物靶向模板DNA中的同源序列,通過(guò)鏈置換DNA聚合酶發(fā)生鏈置換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA合成,對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA單鏈與SSB結(jié)合防止進(jìn)一步替換以穩(wěn)定開(kāi)放的雙鏈體結(jié)構(gòu)。結(jié)果可以通過(guò)與exo探針結(jié)合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量、也可以與nfo探針結(jié)合使用側(cè)流試紙條檢測(cè)或加入染料肉眼可視化檢測(cè)讀取,更適合應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)。
圖2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)原理示意圖
Behrmann等開(kāi)發(fā)了應(yīng)用exo探針的單管RT-RPA方法,與RT-qPCR相比具有100%的診斷敏感性和特異性,檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)7.74個(gè)拷貝,對(duì)于高RNA濃度樣本,可在7 min內(nèi)獲得結(jié)果,該測(cè)定方法是迄今為止SARS-CoV-2最快的基于核酸的檢測(cè)方法之一。Xia等提出同時(shí)靶向N和S基因的一管“樣品進(jìn)結(jié)果出”方案,檢測(cè)限低至每微升0.2個(gè)拷貝。Tholoth等將RPA和LAMP相結(jié)合,構(gòu)建了用于檢測(cè)COVID-19的兩階段等溫?cái)U(kuò)增,稱(chēng)為COVID-19 Penn-RAMP,第一階段在管帽中與外部LAMP引物初步反應(yīng),通過(guò)RPA擴(kuò)增所有靶標(biāo),第二階段試管離心或翻轉(zhuǎn),混合RPA和LAMP體系,啟動(dòng)高度特異性的LAMP反應(yīng),進(jìn)一步組合其他4種RAMP引物,這種嵌套結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度,并且對(duì)抑制劑有更好的耐受性。
RPA方法靈敏度高,無(wú)需加熱部件在常溫下即可擴(kuò)增,并且反應(yīng)速度相較于LAMP更快,然而由于專(zhuān)利原因,相關(guān)試劑需要從指定公司購(gòu)入,導(dǎo)致成本提高并且限制了該方法在即時(shí)檢測(cè)上的應(yīng)用。
2.2.3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(nicking enzyme amplification reaction,NEAR)
NEAR原理見(jiàn)圖3,反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶和恒溫?cái)U(kuò)增DNA聚合酶驅(qū)動(dòng),DNA模板與引物雜交,延伸產(chǎn)物被下一個(gè)模板置換,置換產(chǎn)物互補(bǔ)鏈延伸形成切口酶識(shí)別位點(diǎn),切口酶識(shí)別并切割雙鏈DNA中的一條鏈的特定短序列形成缺口,恒溫?cái)U(kuò)增的DNA聚合酶從引物的3′端延伸核苷酸繼續(xù)合成短序列,得到NEAR擴(kuò)增雙鏈,通過(guò)切割、延伸循環(huán)不斷擴(kuò)增靶標(biāo)DNA模板,設(shè)計(jì)分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號(hào)用于定量。NEAR可達(dá)到指數(shù)速率擴(kuò)增,該方法的優(yōu)勢(shì)在于速度和靈敏度,缺點(diǎn)在于短序列的設(shè)計(jì)存在高假陽(yáng)性的可能。
圖3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)原理示意圖
3 檢測(cè)方法
3.1 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)
實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)原理為在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過(guò)程中讀取熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)定量。在RT-PCR常用的方法為嵌入熒光染料法和Taqman探針?lè)?。嵌入熒光染料法是指使用能與DNA擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性結(jié)合的熒光染料(例如SybrGreen),Taqman探針?lè)ㄊ侵冈O(shè)計(jì)包含5′熒光團(tuán)和3′淬滅基團(tuán)的短的寡核苷酸探針與DNA模板中的序列退火,Taq聚合酶通過(guò)其5′至3′核酸外切酶活性切割退火的探針上的熒光基團(tuán),使其發(fā)出熒光。測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)即可進(jìn)行定量。RPA在常溫下就可以反應(yīng),其結(jié)果可以通過(guò)與exo探針結(jié)合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。Behrmann等引入內(nèi)部淬火探針(exo-IQ)的概念,猝滅基團(tuán)通過(guò)內(nèi)部linker連接在兩個(gè)核苷酸之間,克服了exo探針對(duì)胸腺嘧啶距離的設(shè)計(jì)限制,該策略大大簡(jiǎn)化了exo探針的設(shè)計(jì)。在標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室采用的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)需要體積較大的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀,檢測(cè)人員也需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練,因而專(zhuān)門(mén)為即時(shí)檢測(cè)開(kāi)發(fā)的商業(yè)化檢測(cè)儀器對(duì)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀進(jìn)行小型化處理,使其與樣本提取擴(kuò)增整合并且使結(jié)果易于讀取,更適合即時(shí)檢測(cè)環(huán)境,但由于仍需專(zhuān)門(mén)的儀器,在成本及推廣應(yīng)用方面存在限制。
3.2 可視化檢測(cè)
相比于熒光檢測(cè)需要專(zhuān)門(mén)的儀器進(jìn)行信號(hào)讀取,可視化檢測(cè)只需肉眼觀(guān)察即可,使得結(jié)果的讀取簡(jiǎn)單直觀(guān),更適合即時(shí)檢測(cè)??梢暬瘷z測(cè)包括添加pH敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等方法。
可視化檢測(cè)常應(yīng)用于等溫?cái)U(kuò)增,Park等設(shè)計(jì)針對(duì)Nsp、S和ORF8基因的引物對(duì),應(yīng)用無(wú)色結(jié)晶紫實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè),可在30 min內(nèi)得出結(jié)果,特異性好,檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)100個(gè)拷貝。Yan等通過(guò)實(shí)時(shí)濁度監(jiān)測(cè)和熒光鈣黃綠素可視化,平均可在26.28 min中檢測(cè)到SARS-CoV-2。通過(guò)130個(gè)臨床樣本驗(yàn)證,靈敏度和特異性均為100%。Yu等選擇了一種新型的核酸染料GeneFinder?以進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)和靈敏度。可視化檢測(cè)可以使得等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)一步適應(yīng)即時(shí)檢測(cè)的使用場(chǎng)景,減少操作人員的專(zhuān)業(yè)要求,也不需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備,但相比于熒光檢測(cè),靈敏度會(huì)有所下降。而結(jié)合智能手機(jī)的成像和傳感平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)可視化結(jié)果的量化,相比于目視判定更加客觀(guān),可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。并且使用智能手機(jī)應(yīng)用程序可以快速診斷疾病,監(jiān)控個(gè)人或人群的健康狀況,并向云端上傳地理和人口數(shù)據(jù)用于流行病學(xué)分析。開(kāi)發(fā)結(jié)合智能手機(jī)的設(shè)備有利于快速、準(zhǔn)確地應(yīng)對(duì)當(dāng)前以及未來(lái)的傳染病爆發(fā)。
3.3 側(cè)向流檢測(cè)
基于紙張的側(cè)向流分析(LFA)成本低,易于制造且與即時(shí)檢測(cè)完全兼容,是居家檢測(cè)或資源貧乏地區(qū)檢測(cè)的富有潛力的工具。Xia等進(jìn)一步提出一種更簡(jiǎn)化的甚至可以在家中進(jìn)行檢測(cè)的RT-RPA方法,設(shè)計(jì)了nfo-affinity探針系統(tǒng)以及用于RNA檢測(cè)的側(cè)向流動(dòng)試紙條,可以目視檢測(cè)到zui低1 ag N基因RNA,考察發(fā)現(xiàn)該方法可以簡(jiǎn)單地通過(guò)使用保溫杯來(lái)執(zhí)行。AuNPs合成便利,表面可以被數(shù)百種核酸修飾??赏ㄟ^(guò)由AuNPs聚集引起的顏色變化進(jìn)行比色測(cè)定,閉管的反應(yīng)形式可以zui大程度地減少操作步驟并避免交叉污染。Moitra等用針對(duì)SARS-CoV-2 N基因的巰基修飾的反義寡核苷酸封閉的AuNPs以及RNaseH以實(shí)現(xiàn)在10 min內(nèi)通過(guò)觀(guān)測(cè)沉淀來(lái)“裸眼”選擇性檢測(cè)SARS-CoV-2。但檢測(cè)限為0.18 ng/μL RNA,因此僅采用納米粒子不足以靈敏檢測(cè)病毒RNA,將其引入核酸擴(kuò)增系統(tǒng)中可以增強(qiáng)SARS-CoV-2檢測(cè)的靈敏度和特異性,同時(shí)實(shí)現(xiàn)可視化側(cè)向流檢測(cè)。Zhu等結(jié)合了針對(duì)ORF1ab、N基因的RT-LAMP與基于納米顆粒的側(cè)向流生物傳感器的分析方法,檢測(cè)限每個(gè)反應(yīng)可達(dá)12個(gè)拷貝,分析靈敏度和特異性均為100%。從樣品收集到得出結(jié)果,整個(gè)診斷測(cè)試可在1 h內(nèi)完成。此外也有商業(yè)化儀器采用側(cè)向流技術(shù)作為檢測(cè)方法例如Accula(Mesa Biotech),避免了使用熒光探針和檢測(cè)器的需求。
3.4 CRISPR/Cas檢測(cè)
CRISPR/Cas系統(tǒng)是用于基因編輯的常用工具,有準(zhǔn)確識(shí)別和切割特定序列的能力,而活化的Cas酶在特異性切割靶RNA的同時(shí)能夠非特異性地切割周?chē)h(huán)境中的RNA或DNA,可利用這一特性實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)。
3.4.1 SHERLOCK
SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)的原理見(jiàn)圖4,將病毒RNA靶標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增的產(chǎn)物被T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄回RNA以此擴(kuò)增靶RNA。Cas13a是一種非特異性RNase,識(shí)別并結(jié)合靶向擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物后被激活,對(duì)附近的非靶向RNA進(jìn)行非特異性反式核酸內(nèi)切酶切割即“附帶”切割,裂解ssRNA報(bào)告分子使其從淬滅劑中釋放出熒光染料,用于信號(hào)放大和核酸檢測(cè),并允許熒光,比色,側(cè)向流動(dòng)等讀出方法來(lái)快速檢測(cè)各種靶標(biāo)。Zhang等發(fā)布了用于檢測(cè)SARS-CoV-2的SHERLOCK流程,靶向Orf1ab和S基因,RPA等溫?cái)U(kuò)增后Cas13切割,在商業(yè)化試紙條上讀取結(jié)果,3步檢測(cè)僅需約1 h,但只使用合成的RNA對(duì)新冠病毒CRISPR檢測(cè)的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)估,未用患者樣本進(jìn)行檢測(cè)。Hou等在RNA提取步驟之后,用靶向Orf1ab的SHERLOCK方法得到近單拷貝的靈敏度及良好的特異性。在52個(gè)患者臨床樣本中驗(yàn)證具有100%的臨床靈敏度,周轉(zhuǎn)時(shí)間僅需40 min,證明了其診斷潛力。
圖4 SHERLOCK原理示意圖
SHERLOCK是兩步反應(yīng):首先RT-RPA擴(kuò)增再轉(zhuǎn)錄回RNA進(jìn)行Cas13檢測(cè),由于涉及兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)步驟,因此需要進(jìn)行液體處理和開(kāi)管,這不僅增加了復(fù)雜性,而且大大增加了樣品交叉污染的可能性,不適宜在良好控制的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境范圍外使用。為了使SHERLOCK能在即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣Fan的應(yīng)用,Joung等開(kāi)發(fā)了在一鍋中進(jìn)行SHERLOCK測(cè)試的方法,稱(chēng)為STOPCovid(SHERLOCK Testing in One Pot),將LAMP與CRISPR介導(dǎo)的檢測(cè)步驟相結(jié)合,將經(jīng)典的兩步SHERLOCK轉(zhuǎn)化為單步反應(yīng),不需要樣本提取,檢測(cè)限為100個(gè)拷貝,可在1 h內(nèi)用商業(yè)側(cè)向流試紙條或熒光讀數(shù)檢測(cè),并通過(guò)臨床樣本進(jìn)行了驗(yàn)證,適用于即時(shí)檢測(cè)。
3.4.2 DETECTR
Cas12是CRISPR-Cas效應(yīng)子家族的另一個(gè)成員,具有靶標(biāo)激活的非特異性單鏈脫氧核糖核酸酶(ssDNase)特性,是一種RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶,在結(jié)合靶序列后會(huì)不加區(qū)別地裂解ssDNA。在DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)方法中(圖5),病毒RNA首先被轉(zhuǎn)化為DNA,然后等溫?cái)U(kuò)增后的DNA中的特定靶序列激活Cas12a,Cas12a依次切割ssDNA報(bào)告探針釋放肉眼可見(jiàn)的熒光分子,可實(shí)現(xiàn)靈敏且特異的DNA檢測(cè)。
圖5 DETECTR檢測(cè)原理示意圖
基于熒光的檢測(cè)方法相對(duì)靈敏度更高且可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè),Huang等采用一步式RT-RPA方法從鼻拭子提取的病毒RNA中擴(kuò)增靶區(qū)域,并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物整體轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板中進(jìn)行熒光檢測(cè),使用熒光板讀取器進(jìn)行信號(hào)讀取,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,樣品到結(jié)果的時(shí)間約為50 min,檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)2個(gè)拷貝,靈敏度優(yōu)于qPCR測(cè)定法。該方法可以應(yīng)用于大多數(shù)設(shè)備齊全的臨床實(shí)驗(yàn)室中,但是需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)脑O(shè)備應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè),以使資源缺乏的小型診所也能進(jìn)行該測(cè)試。CRISPR還可以使用側(cè)向流試紙條來(lái)檢測(cè)信號(hào),它不需要任何設(shè)備即可快速讀取結(jié)果,更適合應(yīng)用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的即時(shí)檢測(cè),對(duì)于單樣本測(cè)試,這是一個(gè)很好的解決方案,具有便攜低成本的優(yōu)勢(shì),但使用側(cè)向流試紙條檢測(cè)結(jié)果的方法靈敏度會(huì)有所降低。以上開(kāi)發(fā)的方法仍需對(duì)樣本進(jìn)行開(kāi)管進(jìn)行液體操作,為了解決這一問(wèn)題,Ding等提出All-In-One Dual CRISPR-Cas12(AIOD-CRISPR)檢測(cè)方法,用于核酸擴(kuò)增和CRISPR檢測(cè)的所有成分都在一個(gè)單管反應(yīng)系統(tǒng)中,靈敏度能達(dá)到每微升4.6個(gè)拷貝。而Guo等建立了一個(gè)集成樣品處理方案、重組酶輔助擴(kuò)增(RAA)及CRISPR檢測(cè)的病毒核酸檢測(cè)平臺(tái),檢測(cè)限為每毫升1×10 4拷貝,為了使該平臺(tái)更適合即時(shí)檢測(cè),還構(gòu)建了一個(gè)帶有藍(lán)色LED的便攜式暗盒以便實(shí)現(xiàn)可視化。
基于RNA的CRISPR/Cas策略與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合的快速核酸檢測(cè)技術(shù),可以提高等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定的靈敏度,特異性和可靠性,CRISPR檢測(cè)還可與側(cè)向流讀數(shù)耦合,很適合居家檢測(cè)的場(chǎng)景,為下一代分子診斷技術(shù)的發(fā)展和即時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用展示了廣闊的前景。
4 商業(yè)一體化即時(shí)檢測(cè)方法
商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)方法通常通過(guò)開(kāi)發(fā)配套儀器設(shè)備來(lái)實(shí)現(xiàn)整合提取、擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程,將所有試劑裝在一個(gè)盒中,并通過(guò)使用機(jī)械操作或微流控技術(shù)以基本實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、zui大程度地減少人工操作,減少總測(cè)試時(shí)間,提高周轉(zhuǎn)速度。
從2020年3月開(kāi)始,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)對(duì)多項(xiàng)測(cè)試授予了EUA,值得注意的是有越來(lái)越多基于RT-PCR原理的即時(shí)檢測(cè)商業(yè)化測(cè)試正在被開(kāi)發(fā)。目前獲得臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(CLIA)豁免的基于RT-PCR原理進(jìn)行SARS-CoV-2測(cè)試的即時(shí)檢測(cè)有Cepheid公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2和Mesa Biotech公司 Accula SARS-CoV-2。Xpert Xpress SARS-CoV-2(Cepheid)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)E基因和N2基因兩個(gè)靶標(biāo),在大約45 min內(nèi)即可得到結(jié)果,將整個(gè)過(guò)程自動(dòng)化,不需要用戶(hù)進(jìn)行特殊培訓(xùn)。許多研究團(tuán)隊(duì)將Xpert Xpress SARS-CoV-2與基于實(shí)驗(yàn)室的RT-PCR在臨床樣本中進(jìn)行了比較,顯示出極好的一致性(>99%),并且發(fā)現(xiàn)在較低的病毒水平也能可靠檢測(cè)。Mesa Biotech公司的Accula結(jié)合了RT-PCR分子診斷和側(cè)向流分析技術(shù),僅需30 min即得到結(jié)果并且儀器僅手掌大小便于攜帶。為了評(píng)估Accula測(cè)試的性能,Hogan等比較了100份鼻咽拭子樣品的結(jié)果,總體一致性為84.0%,陽(yáng)性一致性?xún)H有68.0%。對(duì)于病毒載量低的樣品,陽(yáng)性一致性較低,易出現(xiàn)假陰性。這表明Accula 即時(shí)檢測(cè)靈敏度不高,應(yīng)仔細(xì)考慮即時(shí)檢測(cè)的潛在優(yōu)勢(shì)與降低診斷準(zhǔn)確性之間的平衡。國(guó)內(nèi)基于RT-PCR原理的商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)裝置有圣湘生物科技股份有限公司的iPonatic移動(dòng)分子診斷系統(tǒng)、上海透景生命科技股份有限公司2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(卡式熒光PCR法)。iPonatic采用一步核酸免提取技術(shù),并搭配快速核酸檢測(cè)系統(tǒng),一站式完成樣本裂解、核酸提取、PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析。透景生命的檢測(cè)卡盒采用磁珠法進(jìn)行核酸提取,實(shí)現(xiàn)提取擴(kuò)增全程自動(dòng)化,但該方法需要手動(dòng)裝載磁珠和樣本,需要在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行。此外還有能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR(mPCR)的商業(yè)化平臺(tái),例如QIAstat-Dx(QIAGEN公司)、BioFire FilmArray(bioMérieux公司)等平臺(tái)。QIAstat-Dx除了支持液體運(yùn)輸介質(zhì)外,還有獨(dú)特的干拭子直接上樣程序,手動(dòng)操作少于1 min,可在1 h內(nèi)得出結(jié)果。BioFire FilmArray(bioMérieux公司)利用巢式多重PCR結(jié)合微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)1 h快速檢測(cè),巢式PCR技術(shù)可以zui大程度排除其他非特異性病原體核酸物質(zhì)的干擾,同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度。表1列舉了目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時(shí)檢測(cè)方法。
等溫?cái)U(kuò)增由于不需要借助熱循環(huán)儀,在恒定溫度下即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和可視化檢測(cè),因而可以大大減小設(shè)備體積,相對(duì)于RT-PCR更適合用于資源缺乏地區(qū)即時(shí)檢測(cè)的開(kāi)發(fā)。北京航空航天大學(xué)、華西醫(yī)院聯(lián)合研發(fā)出一款針對(duì)ORF/N/E 3個(gè)基因位點(diǎn)的便捷式病原體核酸快速檢測(cè)儀,由便攜式檢測(cè)儀和等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)錐形微孔陣列高通量芯片構(gòu)成,能實(shí)現(xiàn)高靈敏度、低成本(1萬(wàn)元/臺(tái),10元/人份)、快速(25 min)、高通量(64個(gè))即時(shí)檢測(cè),113例核酸樣本檢測(cè)表明靈敏度大于95%,特異性大于95.3%。優(yōu)思達(dá)公司EasyNAT即時(shí)分子診斷系統(tǒng)是已獲批的一體化等溫?cái)U(kuò)增儀器,試劑用玻璃化技術(shù)預(yù)混裝在全自動(dòng)反應(yīng)管中,將裂解、磁珠提取、純化、洗脫、擴(kuò)增等過(guò)程在外部磁導(dǎo)的作用下自動(dòng)化完成,整個(gè)過(guò)程耗時(shí)79 min,全程密閉檢測(cè),無(wú)需專(zhuān)業(yè)PCR實(shí)驗(yàn)室。Abbott公司的ID Now是利用NEAR原理的一種商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)方法,它設(shè)計(jì)靶向擴(kuò)增SARS-CoV-2的RdRp片段,可在5 min內(nèi)提供0.125 copies/μL的靈敏度。檢測(cè)陽(yáng)性樣品僅需5 min,陰性樣品也只需13 min。用熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)特異性鑒定擴(kuò)增的RNA靶標(biāo)。然而,有評(píng)估顯示ID NOW與RT-PCR陽(yáng)性一致率僅有約80%,這意味著Abbott公司的ID Now的性能有很大的局限性,對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性和中等陽(yáng)性樣品,ID NOW表現(xiàn)良好,但對(duì)于弱陽(yáng)性樣品靈敏度降低,因此在對(duì)疑似患者使用此測(cè)試時(shí),應(yīng)考慮到靈敏度的問(wèn)題。等溫?cái)U(kuò)增一體化儀器適合資源缺乏地區(qū)以及人流聚集環(huán)境下的便攜式病原體快速檢測(cè),但目前對(duì)于低成本、高準(zhǔn)確度、適合即時(shí)檢測(cè)的等溫核酸擴(kuò)增儀的開(kāi)發(fā)仍處于探索階段,有廣闊的發(fā)展前景。
表1 目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時(shí)檢測(cè)方法
5 總結(jié)和展望
相比于基于實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR流程,即時(shí)檢測(cè)方法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn),結(jié)果出”,可以促進(jìn)更快的臨床決策,以社區(qū)為單位進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)可以減輕中心醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室的負(fù)擔(dān)。目前已開(kāi)發(fā)出許多為了更好地應(yīng)用于新冠即時(shí)檢測(cè)而在提取、擴(kuò)增、檢測(cè)等方面進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)的方法,包括簡(jiǎn)化提取步驟,優(yōu)化即時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景下基于RT-PCR、核酸等溫?cái)U(kuò)增等原理開(kāi)發(fā)的方法(表2)的擴(kuò)增性能、采用熒光讀取、可視化技術(shù)、側(cè)向流檢測(cè)和CRISPR檢測(cè)以方便結(jié)果識(shí)別讀出等,推動(dòng)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確,快速,便攜,簡(jiǎn)便和低成本的即時(shí)檢測(cè)目標(biāo)。但目前針對(duì)新冠檢測(cè)的即時(shí)檢測(cè)方法大多為概念研究階段,距離商品化應(yīng)用還有距離。而已被批準(zhǔn)上市的即時(shí)檢測(cè)方法需要在專(zhuān)門(mén)的配套儀器上使用,實(shí)現(xiàn)了提取、擴(kuò)增、檢測(cè)一體化,極大推動(dòng)了即時(shí)檢測(cè)的發(fā)展,但大多仍然需要專(zhuān)業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境操作,且儀器價(jià)格較高、市場(chǎng)占有率小等問(wèn)題也會(huì)限制其在即時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景中的應(yīng)用,此外部分商品化儀器實(shí)際檢測(cè)性能仍有待進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn),市場(chǎng)上仍缺少真正能夠?qū)崿F(xiàn)普通大眾居家或資源缺乏地區(qū)在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行測(cè)試的準(zhǔn)確可靠的即時(shí)檢測(cè)試劑盒,對(duì)于在受控環(huán)境之外和非專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的工作人員進(jìn)行測(cè)試時(shí)的污染和假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)也是即時(shí)檢測(cè)所面臨的問(wèn)題。即時(shí)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)主要是為了應(yīng)用于資源短缺地區(qū)或待檢樣品數(shù)超過(guò)當(dāng)?shù)貦z測(cè)能力地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè),這就要求理想的研發(fā)方法能夠具有以下特征:(1)裝置盡量小型化、便攜化;(2)用戶(hù)友好,操作簡(jiǎn)單,方便非專(zhuān)業(yè)操作人員的培訓(xùn);(3)考慮到生物安全問(wèn)題,盡量設(shè)計(jì)為免提取密閉自動(dòng)化操作,減少開(kāi)蓋,保證非專(zhuān)業(yè)人員在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境操作的安全;(4)周轉(zhuǎn)時(shí)間短,能在1~2 h或更短時(shí)間內(nèi)出結(jié)果;(5)信號(hào)讀取方便直觀(guān),可以直接得出是否為陽(yáng)性的結(jié)果,例如可視化技術(shù)。除了為快速控制新冠病毒的傳播提供有力支持以外,這些針對(duì)新型冠狀病毒的即時(shí)檢測(cè)研究成果也可以應(yīng)用于其他疾病的緊急防御和快速部署,有助于應(yīng)對(duì)未來(lái)可能的新興傳染病。
表2 基于不同原理的SARS-CoV-2核酸即時(shí)檢測(cè)方法對(duì)比
引用文本
鮑瑤菲,薛茜茹,武海萍,鄒秉杰,宋沁馨,周?chē)?guó)華.用于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的即時(shí)檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2020,51(6):635-645.
本文系《中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》原創(chuàng)。版權(quán)屬于《中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》。
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