免疫療法刺激固有的免疫系統(tǒng)對抗惡性細胞徹底改變了臨床上的癌癥治療模式，已成為多種癌癥的標準治療方法。鑒于RNA可以通過抑制、增強、替代甚至編輯來調(diào)節(jié)基因表達，且mRNA和siRNA療法在癌癥免疫治療中展現(xiàn)出具有巨大潛力，因此RNA可以應用于沉默免疫檢查點基因、制造CAR-T細胞或者用作抗腫瘤疫苗等。然而，RNA療法在癌癥治療中的臨床應用受到RNA本身的不穩(wěn)定性和各種生理屏障阻礙的限制。盡管存在這些挑戰(zhàn)，核酸藥物近年來獲得迅速的發(fā)展，特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在新型冠狀病毒COVID-19 疫苗的應用進一步增強了人們對RNA治療藥物在其他疾病治療應用的信心。

當下RNA介導的免疫療法仍然面臨著一些應用阻礙：1、LNPs主要在肝臟中積累并被肝細胞內(nèi)化，從而限制了它們對其他器官和組織相關(guān)疾病的治療效用；2、LNPs存在穩(wěn)定性問題，LNP需要超低溫儲存（例如BNT162b2：-60和-80 ℃；mRNA-1273：-15和-25 ℃），這對RNA藥物在全球運輸、儲存和流通是個極大的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要探索替代策略以開發(fā)用于RNA遞送的臨床適用平臺技術(shù)。

2024年6月10日，華南理工大學生物醫(yī)學科學與工程學院王均教授團隊在材料科學領(lǐng)域國際刊物《Advance Functional Materials》上發(fā)表了題為“Long-Term Storage Stable Vesicle-Like Nanoparticles of Lipid and Polymer for siRNA and mRNA-Mediated Cancer Immunotherapy”的研究論交。第一作者：華南理工大學生物醫(yī)學科學與工程學院的博士研究生陳超然，通訊作者：華南理工大學生物醫(yī)學科學與工程學院許從飛教授、楊顯珠教授與王均教授。研究團隊通過使用臨床批準的材料兩親性聚合物PEG5K-b-PLGA11K、DLin-MC3-DMA和DOTAP，成功開發(fā)了用于siRNA和mRNA介導的癌癥免疫治療的VNP遞送平臺。篩選后的VNP體系的轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine RNAiMAX、LNP相當（圖1g）。此外，因為RNA被有效封裝在VNP的中空膠囊狀內(nèi)核中，即使在6個月的儲存期（-20 ℃）后VNP也能保持優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率（圖1hi）。

圖1 VNP-siRNA儲存穩(wěn)定性研究

研究團隊還建立了小鼠黑素瘤治療模型和小鼠B16-OVA腫瘤預防模型，分別用以評估VNP介導siRNA和mRNA遞送的體內(nèi)免疫治療效果。攜帶靶向PD-L1和CD47的siRNA的VNP能夠在小鼠皮下黑素瘤治療模型中增強腫瘤浸潤性CD8+ T細胞比例并改善巨噬細胞吞噬作用，從而表現(xiàn)良好的免疫治療效果（圖2ab）；攜帶表達OVA抗原mRNA的VNP疫苗在小鼠B16-OVA腫瘤預防模型中產(chǎn)生了強大的免疫效應抗原，在多組織中都檢測到了特異性CD8+ T細胞，可以有效抑制腫瘤生長（5/8小鼠出現(xiàn)完全緩解情況）和預防腫瘤肺轉(zhuǎn)移（幾乎100%）（圖2cdefg）。本研究開發(fā)出了具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率以及較長的保質(zhì)期的RNA遞送平臺技術(shù)VNP，為探索新型RNA遞送系統(tǒng)提供了簡便的策略。

圖2 VNP-RNA在腫瘤中的治療效果

附：VNP-siRNA的制備和表征

文中使用雙乳液法制備VNPs-RNA，其中兩親性 mPEG-b-PLGA、可電離脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)溶解在有機相中，而siRNA作為模型 RNA 藥物溶解在無 RNA 酶的水相中（圖3a）。為了確定用于RNA遞送的最佳VNP配方，初步研究了裝載效率與 DOTAP 和 DLin-MC3-DMA 的質(zhì)量比之間的關(guān)系。結(jié)果表明，siRNA 的裝載效率高度依賴于 DOTAP 的含量，加入1.0 mg DOTAP 后達到98%，因此，配方中固定DOTAP 的質(zhì)量為1.0 mg（圖3b）。隨后，研究了DLin-MC3-DMA 和 DOTAP 的質(zhì)量比對 VNP-siRNA 性能的影響，結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)表明添加 DLin-MC3-DMA 對 siRNA 的裝載效率影響微乎其微，粒徑和 zeta 電位略有增加。此外，研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞是 VNP-siRNA 的主要內(nèi)化途徑，內(nèi)吞程度與 MC3/DOTAP 的質(zhì)量比直接相關(guān)，DLin-MC3-DMA 含量增加會導致細胞通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞攝取減少（圖3j）。

對VNP進行體外篩選和體內(nèi)生物分布研究。體外篩選結(jié)果表明，在不同腫瘤細胞類型中，MC3/DOTAP 質(zhì)量比的增加有效地增強VNP對CD47 基因（在各種腫瘤細胞中高表達，可以逃避巨噬細胞的吞噬作用）的敲低效果，但不同細胞類型的最佳配方各不相同。體內(nèi)生物分布研究結(jié)果表明，當 MC3/DOTAP 的質(zhì)量比等于或小于1:1時，VNP 的腫瘤積累效果更好 (圖3f)。綜合考量，MC3/DOTAP 的質(zhì)量比以1:1形成最終 VNP配方，用于后續(xù)涉及免疫檢查點基因沉默的抗癌研究。

圖3 VNP-siRNA的制備和表征

注：f：（I）Heart,（II）lung,（III）liver,（IV）kidney,（V）spleen,（VI）tumor.